長坂蛾庭

2013年11月19日

たのしいコナジラミの標本づくり

にゃんぱすー!
みんなでやるのん。

コナジラミの標本の作り方をまとめていますが道は険しいです。
試行錯誤につきあっていただける方募集してます。

【履歴】
2013-11-19: 作成。
2013-11-22: 少し手直し。
2013-12-3: 中途半端ですがいったんUPします。 KOH容器、時計皿あたりを少し修正しました。 ビデオがあるとわかりやすいのでボチボチ入れていきたいと思いますが、 とりあえず剥離と脱ロウのビデオを入れておきました。

10件のコメント »

  1. やぁ、これは・・・・・、マニアには、なかなか楽しい記事です。
    とくに試行中のマニュアルを見られることは、ありえないことなので。
    内容の量が膨大で、質問やコメントもすぐにはできません。
    ゆっくり読んで、そのうちおいおいと、いたしましょう。

    コメント by ezo-aphid — 2013年11月23日 @ 19:44

  2. ezo-aphidさん、おはようございます。
    アブラムシの標本も似たような作業だろうと思うのですが、どうなんでしょう。シラカシコムネとかはむしろコナジラミのやり方の方が適していそうですし、何か面白いヒントが隠されているかもしれませんね。感想お待ちしています。
    失敗した場合も、その情報を共有すれば今後のために活かせると思うので、ぜひ教えてください。

    コメント by Hepota2 — 2013年11月24日 @ 07:38

  3. アブラムシと較べると、薄くて小さいので取り扱いがずいぶん違うようです。
    アブラムシでは曲げた微針にひっかけて、処理液へ移動させています。

     横着して手順をもっと減らしたいのですが、以下のような点が気になります。
    1)KOH処理を、40℃8時間くらいとすると、ほとんどの場合は(子虫を除く)内容物が溶けて、体を押しつぶすだけで済むみます。コナジラミの場合はどのような問題がありましたか?
    2)脱ろうは、KOH処理後にひっかくだけでは剥がれないのでしょうか?
    3)私は、酸性フクシン染色に、(KOH処理後の)水洗時に薄い水溶液を数滴落としています。染色程度の様子を見ながら、滴数を調節しています。・・・・という方法も。
    4)脱水をEtOH99.5でやめて、クローブオイルを加えると標本付近に水泡ができますか?
    5)封入:スライドグラス上に広げたバルサムに標本を配置したら、それにつなげて新たに縦一条のバルサムを引き、その上にカバーグラスの一端を置いてから、反対の一端を針にひっ懸けてゆっくりとおろしてゆく。そうすると、気泡は入りにくいのですが。
    6)ラベルは標本と逆の方向の方が便利です。(倒立像の)生物顕微鏡のためのラベルですから。
    7)ラベル紙の厚さとサイズは、スライドの保存方法に関係します。スライドボックスだと、紙の厚さは自由ですが、スライドグラスの両端2mmほどは開けておかなくてはなりません。
    スライドグラスより厚い紙を使えば、ケースの中に密着して並べられるのでスライドが数千枚となっても場所を取りません。こちらのほうが安上がりかと思います。
    8)乾燥は、障子のように仕切りのある板(段ボール等で自作可能)の上に置きっぱなしですが、薄いバルサムではキシレンが蒸散して空気が入り込むので、しばらくは様子を見る必要があります。

    KOH処理容器:ポリスチレン製のマイクロウエルプレート(96穴、7mm径×10mm深さ)というのがバイテクや医療検査の使い捨て器具にあります。自動分析用サンプルカップの2ccは、内径12mm×20mm深さ、というものがあります。どちらも販売ロットが大きすぎるので、どっか貰えるところがあれば・・・。
    スポイト:ケミカルスポイト(低密度ポリエチレン製)、容量が1,2,3,5,10cc、10本入りで300~500円です。

    コメント by ezo-aphid — 2013年11月24日 @ 23:31

  4. ezo-aphidさん、おはようございます。

    これから出かけますので、とりあえず2点。

    1)コナジラミの場合は、保温調理器で50°Cで開始して一晩(8時間ほど)置いておいてもまったく効果がない場合がありました。落ち葉についたまま蛹越冬する種類は12月から5月以降(おそらく)まで半年間にわたって休眠するので、夏に得られる個体とは状態がかなり違うのではないかと考えています。KOH処理時間を調節してうまくできるのかもしれませんが、状態により広い範囲で調節が必要になりそうですし、長く浸けておくと外皮も溶け出す気がします。脱ロウ、穴あけ、KOH処理の途中で一度押しつぶすという3つの処理を行った方が、比較的誰にでも安定して処理できるような気がしてます。まだ数をこなしていないので明確な返答はできませんが。

    2)剥がれますが、剥がれ難くてけっこう時間がかかる場合があります。キシレンに浸けておく場合とトータルな手間はあまり変わらないように思います。KOH処理時間の問題もあって、やっておいた方が得策かなぁと考えております。なお、背面を軽くつついてやわらかいようだと、ワックスのプレートは無いのでこの処理は不要です。ワックスで覆われている場合はカチカチ音がします。

    コメント by Hepota2 — 2013年11月25日 @ 07:38

  5. つづきです。

    3)途中でやめるとひどくムラになってしまうのですが、私の染色液が濃すぎるのかもしれません。ちょっと薄めて試してみます。

    4)EtOH100を使わないで済ませられるかっていうことでしょうか? 試したことはありませんので、ちょっとやってみます。残った水分をクローブオイルに浸けている間に蒸発させないと無理な気がしますが、長時間つけておけば大丈夫なのかもしれません。脱水には氷酢酸を使う方法もあるようで、脱水以降の行程はアブラムシと同じで良い気がします。

    5)バルサムが動くと検体も動いてしまうのですが、少し粘度が高くなってからやると良いのかもしれません。試してみます。

    6)重要なのは統一されているかどうかです。逆向きにさすことが決まっているなら別に不便でも何でもありません。で、逆向きに配置するのは世界標準なのでしょうか? Dooley2002の最後の方にある LABELING TECHNIQUES のページには、正立で置かれているのですが?

    7)2mmというのはスライドボックスの溝の分でしょうか? スライドボックスの溝はけっこう広くて、そうとう厚い紙を貼っても大丈夫そうです。「スライドグラスより厚い紙…」はカバーグラスの誤りでしょうか? 管理方法については、テキストに追記しておこうと思いますが、具合の良い箱はありますか?

    8)今はテーブルの上に並べて1週間ぐらい経過したらスライドボックスにしまっちゃってますが大丈夫っぽいです。仕切りのある板はというのはマッペのことでしょうか? 縦に積み上げて使うためのものでしょうか?

    コメント by Hepota2 — 2013年11月26日 @ 05:44

  6. 3)水溶液の場合、滴数を増やせば濃く染まるのですが。 たしかに薄い染まりの場合はムラができています。見えやすい”程度”で手を打つしかないかなぁ。

    4)アブラムシでは脚や触角に水分が残りやすく、脱水が不完全だと若干問題です。その点、コナジラミは問題が起きにくいのでは・・・、と思ったのです。
    油中では水分は無くならないでしょうね。

    5)バルサムが濃い方が、検体が沈まず泳いでしまうと思います。薄いバルサム中に沈めれば、泳がないと思うのですが・・・・。小型の標本は、期待した位置にはなかなか止められませんね。

    6)標準だと思います。標本を観察しながら、データを再確認したり、追加の記事をラベルに記入したりしますので。実体顕微鏡で見るためのものなら、倒立の方が不便です。

    7)スライドボックスの場合、紙の厚さは自由です。木製では溝の広さがぎりぎりのものもあるので、ラベルの紙は両端に無い方が良いです。
    厚紙は、カバーグラスの表面にあたらないよう「カバーグラス+バルサム」より厚いものにします。この場合、図書館のカードボックスのような「ひきだし型」のケースに、立てて密着して並べますの。ワーキングボックスなどの整理箱のうち、「ナインボックス」というポリスチレン製の商品があります。引き出しが、幅99mm、奥行き220mm、深さ42mmで、マットを敷いています。9個の引き出しにそれぞれ100枚くらいは入ります。本体のサイズは、幅344×奥行き240×高さ155mmで、重ね積みできます。

    8)1週間の自然乾燥で問題が無いというのはいいですね。たぶん、バルサムの量が少なくて済むためだと思います。分厚いヤガ類の交尾器の場合では、1月ほど自然乾燥では全く不十分で、立てると非常にゆっくりとバルサムが流れ落ちてきます。アブラムシでは標本の原型に戻ろうとする力で、1週間以内に空気を吸い込む場合もあります。
    マッペは平積みにしておけば、ときおり検鏡しつつ、自然乾燥にも時間をかけられます。

    コメント by ezo-aphid — 2013年11月26日 @ 19:25

  7. マイクロウェルプレート:穴多すぎですし、ポリスチレンは軟化温度が低い(60〜80°C)とか欠点がいくつかあって、あんまり使いたくないです。今使っているチューブを短くカットして、複数刺さるホルダーを自作した方が使いやすそうな気がします。

    スポイト:時計皿の液体を排出するのにポリエチレン製のスポイトを一時期使っていましたが、先端が太いので表面張力(?)の影響を受けやすく液体が動いてコナジラミもつられて動くので、先端は細い方が使いやすい気がしています。

    7)厚い紙を使い、端2mmあけておくのが良さそうですね。
    ナインボックスとうのはコレですね。情報はテキストの方に入れておきます。

    8)垂れることはありませんが、ホコリを拭こうとしてズルっとやってしまったことが2回ぐらいあります。人に送る場合には、しっかり乾燥させたいです。

    コメント by Hepota2 — 2013年11月28日 @ 15:50

  8. こんにちは、

    例の紅葉のコナジラミ「Parabemisia sp.」ですが、本日やっと見つけて3個体ほど捕獲しました。
    早速、お送りしたいと思いますので、連絡をお願いします。

    コメント by そら — 2013年12月1日 @ 13:31

  9. そらさん、こんばんは。
    探していただき、ありがとうございます。
    メール送りました。

    コメント by Hepota2 — 2013年12月1日 @ 19:09

  10. alpha-2013-12-3 アップ。

    手直ししている途中なのですが、一度アップしておきます。

    前のバージョンには書いてませんでしたが、KOH容器は丸底かV底が良いと思います。東急ハンズで販売されている『丸底ドラム』が使えるかもしれません。フタが透明でないのですが。3mlのがネット在庫無しになっていたので、5mlと10mlのを注文してみましたので、すこお待ちください。
    丸底ドラム 3ml

    丸底のクリーム容器にも使えるものがありそうです。

    コメント by Hepota2 — 2013年12月3日 @ 12:17

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